连字符分析仪是一种将两种不同技术的能力融合在一起,形成具有新能力的新分析技术的仪器。显微镜分光光度计就是这样一个连字符的仪器;它是一种混合,结合了光学显微镜的放大力和紫外-可见-近红外范围分光光度计的分析能力。因此,显微镜分光光度计可以用来测量微观样品区域从深紫外到近红外的分子光谱。它们可以配置为许多不同类型的光谱,因此,用于测量吸光度,反射率,甚至发射光谱,如荧光和光致发光,微米大小的样品。加上专门的算法,显微镜分光光度计也可以用来测量薄膜的厚度或作为显微镜样品的色度计。

使用显微镜分光光度计的原因有很多。最明显的是光谱可以从小于一微米的样品区域中获得。此外,这些仪器只需要少量的固体或液体样品。另一个优点是对许多样品很少或不需要准备。分光光度计通过光谱学进行颜色比较更准确,因为这些仪器的光谱范围更广,可以校正光线的变化,并可以测量每个波长带的光的强度。

在微型光谱检查到来之前,分析许多类型的微观样本的唯一方法是使用微化学测试,然后使用某种视觉检查。不幸的是,这些方法往往是破坏性的,需要大量的样品,并遭受人类视觉系统的不准确性。显微镜分光光度计避免了这些问题,并且可以“参见”超出人眼的范围,并检测不会出现的变化。

显微镜分光光度计设计

显微镜分光光度计通过UV可见NIR范围分光光度计集成光学或光学显微镜(图1)。显微镜是一种设计用于放大小物体的图像以允许它们进行研究。分光光度计是通过可见和近红外区域测量来自紫外线的每个波长光的强度的仪器。使用适当配置的显微镜分光光度计,一个能够在亚微米级上采用采样区域获得吸光度,反射和发射光谱。

为了涵盖具有良好图像和光谱质量的这种宽频谱范围,采用分光光度计构建并集成了定制设计的显微镜。标准光学显微镜具有仅覆盖可见区域的一部分的有限光谱范围,因为用于光学器件以及光源本身的材料。现代显微镜分光光度计利用定制的显微镜,光学设计和光源针对深紫外线进行优化。

分光光度计本身也必须设计用于微谍谱检查以获得良好的光谱结果。这意味着分光光度计必须高度敏感,同时仍保持可接受的光谱分辨率。稳定性也是一个问题,因为显微镜分光光度计是单光束仪器,并且必须在测量样品之前获得参考光谱。仪器还必须具有高动态范围,因为在测量相同的样品时经常从透射或反射微穴位切换到荧光光谱的频率。这允许您从微观样本上的完全相同的位置获得不同类型的光谱信息。

分光光度计与显微镜的集成均致力于重要。虽然显微镜和分光光度计必须针对微型光谱检查进行优化,但显微镜分光光度计操作的关键是使它们能够一起工作的硬件。该界面有几个基本要求。最重要的是,必须将通过显微镜收集的电磁能与样品中的电磁能引入分光光度计。但是,用户必须能够可视化样本测量区域,而且还可以看到周围的样本。这是通过将分光光度计的入口孔在与样品图像中的相同焦平面上的分光光度计的入口孔完成来完成的。然后可以用显微镜阶段移动样品,因为一个通常用显微镜做,直到入口孔的图像在待测区域上。在图2中,图像中心中的黑色正方形是分光光度计的入口孔径。所有这些都是实时完成的,以便显微镜样品的光谱快速且容易。

图2。当用显微镜分光光度计对样品成像时,图像中心的黑色正方形是分光光度计的入口孔径。用户只需移动样品台,黑色方块就会叠加到OLED显示屏所测量的区域。(Courtesy Craic Technologies,Inc。)

如图3所示,显微镜光学将光聚焦到样品上。然后用显微镜物镜从样品中收集电磁能。物镜发出的光聚焦在分光光度计的镜面入口光圈上。大部分光线从入口光圈表面反射到相机上。分光光度计的光圈也会被相机成像,这样它就会出现在样品上的一个黑色的正方形(图2)。这使得显微镜分光光度计可以简单快速地校准。光线通过入口光圈,然后进入分光光度计,在那里光谱被测量。

图3.示出了用于荧光微型光谱学和成像的显微镜分光光度计的光路的示意图。(Courtesy Craic Technologies,Inc。)

显微镜可以配置有不同的照明方案,这取决于要进行的实验类型。与白光的入射照明允许从深紫外线到近红外的反射微穴位。入射照明还可用于荧光或光致发光微型光谱检查。另外,通过聚焦在样品上通过显微镜冷凝器聚焦到样品上的变速器微型特点。

微型光谱应用的应用

第一个显微镜分光光度计是在20世纪40年代开发的,从那时起,许多不同的应用被开发出来。由于能够获得显微样品区域的光谱,显微镜分光光度计被用于从大学实验室到生产线的质量控制和故障分析。

法医科学。自20世纪80年代初以来,对法医证据的分析是显微镜分光光度计的最重要应用之一。最大的努力是分析痕迹证据,特别是纺织纤维和涂料芯片1,2。随着他们的名称表明,这些类型的样品通常是微观的,并且是证据,不应通过测试损坏或破坏。利用纤维,使用显微镜分光光度计测量单个纤维的UV可见光瘤吸光度和荧光光谱。涂料芯片通常是横截面的,然后测量每层的吸光度谱,从而可以将已知和质疑样品与高度的辨别程度进行比较。

平板显示器。现代平板显示器由数百万多彩色像素组成。随着该技术的进展,像素变得越来越小,更紧密地挤满了更大的表面。最现代化的显示器使用不同的技术,例如量子点和有机光线发光二极管,以在微观尺度上产生不同颜色的像素。显微镜分光光度计用于帮助这些材料作为可行光源,最终如显示3,4。显微镜分光光度计也用于生产过程中,以确保像素的颜色和强度在整个显示器上一致,从而确保显示器上的明亮且均匀照射的图像。

活力。煤炭和石油源岩含有玻毛石和其他麦克林。显微镜分光光度计用于级热成熟度,因此煤,焦炭和石油源岩的能量含量。这是通过测量玻曲线在抛光样品上的绝对反射率来完成的。根据反射率,可以确定样品的热成熟度。

纳米技术。显微镜分光光度计也是基于测量传输,反射率和发射光谱微观样本区域的能力推进纳米技术和材料科学。一个快速增长的应用领域正在开发和使用表面等离子体共振(SPR)6,7,8。

通过用光照亮平面金属表面或纳米级金属颗粒来激发表面等离子体(图4)。当这些纳米颗粒或表面与其他材料相互作用时,这些材料的光学特性的变化发生。因此,正在进行大量工作以开发出现某种形式的等离子体共振的新材料,而且还可以构建具有这些现象的设备。后者包括各种类型的生物传感器和微流体装置传感器。显微镜分光光度计测量SPR材料的光谱如何在不同的条件下改变,使研究人员能够表征新材料的能力,然后“调谐”材料进行特定光学效应。

图4.作为湿度传感器开发的金纳米粒子薄膜的UV可见NIR吸光光谱。红色迹线是来自膜的干燥表面,而蓝迹线是来自薄膜的湿润表面。(Courtesy Craic Technologies,Inc。)

结论

显微镜分光光度计是一种将光学显微镜与分光光度计结合起来的技术,这样人们就可以获得显微样品区域的光谱。这样的仪器能够吸收光谱和反射光谱从深紫外光穿过可见光并进入近红外区域。显微镜分光光度计也可以测量荧光和其他类型的发射光谱。这些设备在许多领域都有应用,包括法医学、半导体和光学薄膜厚度测量、生物技术和最新的材料科学。

参考

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  2. 法医涂料分析中微型分光光学光学光学光学光学光谱法的标准指南,美国测试与材料学会。
  3. Buchnev,O.,Podoliak,N.,&Fedotov,V. A.(2018)。液晶填充的元像素,可切换不对称反射和透射率.J.分子液体学报,2003,31(4):413 -414。
  4. Rezaei,S. D.,Hong Ng,R.J.,Dong,Z.,Ho,J.,Koay,E.H.,Ramakrishna,S.,&Yang,J. K.(2019)。具有恒定亚波长分辨率的宽色域等离子体调色板.ACS纳米,13(3),3580-3588。
  5. 煤的岩体分析方法 - 第5部分:测定显微镜的方法的荧光石反射率, ISO 7404-5,国际标准化组织,2009。
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本文是由Paul Martin博士,墨西哥古代科技(San Dimas,CA)编写的。有关更多信息,请联系Martin博士此电子邮件地址受到垃圾邮件程序的保护。您需要启用Javascript来查看它。,或者访问在这里


Photonics&Imaging Technology杂志

本文首次发表于2021年9月号光子和成像技术杂志。

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